bismark 识别甲基化位点-比对篇

bismark 识别甲基化位点-比对篇

​​bismark​​  软件根据序列的比对情况就可以识别甲基化位点，首先需要对基因组建立索引，建好索引之后，就可以开始比对了。

我用的软件自带的单端测序的数据集进行测试， 命令如下

bismark hg19_bismark_db/  test_data.fastq -o test

第一个参数为​​bismark_genome_preparation​​​命令构建的基因组索引所在的目录，第二个参数为需要比对的序列， ​​-o​​参数指定输出的目录

​​bismark​​​的参数很多，通常情况下，采用默认参数就好。其他参数全部默认的情况下：​​bismark​​ 比对的过程分为以下几步：

1 . 将输入序列进行C->T的转换

软件在运行过程中的log信息如下：

Input file is in FastQ formatWriting a C -> T converted version of the input file test_data.fastq to test_data.fastq_C_to_T.fastqCreated C -> T converted version of the FastQ file test_data.fastq (10000 sequences in total)Input file is test_data.fastq_C_to_T.fastq (FastQ)

2 . 将C-> 转换好的序列分别与 C->T 转换的基因组和G->A 转换的基因组进行比对

Now starting the Bowtie 2 aligner for CTreadCTgenomeUsing Bowtie 2 index: hg19_bismark_db/CT_conversion/BS_CTUsing Bowtie 2 index: hg19_bismark_db/GA_conversion/BS_GA

我用的是 ​​1.9.0​​​ 版本的bismark, 现在绝大多数的BS-seq的文库构建都是采用illumina提供的的标准protocol, 构建出来的文库都是链特异性的文库，所以从​​0.7.0​​​版本之后的bismark, 默认只做两次比对，但是这个默认情况只适合链特异性文库，如果你的文库不是链特异性的，那么就需要添加​​--non_directional​​选项。

何为链特异性文库，就是说链是由方向性的。对于普通的文库，测序的插入片段都是双链，但是链特异性文库是单链。通过在反向互补时添加特定的标记，在双链合成后，将第二条链去除，最后用于测序的就只有一条链了。如果一个甲基化位点发生在基因组的正链上，那么这段区域在测序时插入序列就只有正链上的序列，如果发生在负链上，则只有负链作为插入序列。

在​​bismark​​​中，将基因组的正链定义为​​top strand​​​ ， 简称​​OT​​​, 负链定义为​​bottom strand​​​, 简称​​OB​​​; 亚硫酸氢盐处理后，正负链之间并不是完全的反向互补的，将​​OT​​​链的反向互补链定义为​​CTOT​​​, 将​​OB​​​链的反向互补链定义为​​CTOB​​。

对于链特异性文库而言，由于插入序列为单链，只需要比对​​OT​​​和​​OB​​​两条链即可，大大减少了运算量，所以目前illumina的标准BS-seq protocol构建的文库都是链特异性文库，新版的​​bismark​​默认的运行方式也是针对链特异性文库的。

图中展示了​​bismark​​​比对的过程， 包括了原始序列转换和比对两个过程：原始序列转换包括两种方式：

C->T 的转换G->A 的转换

比对也包括两种基因组：

C->T 转换的基因组G->A 转换的基因组

所以每条reads 最多会有 2 X 2 = 4 种比对情况，对于链特异性的文库，只有C->T  转换，所以只有2种比对情况。

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